PCR, είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, η οποία αναφέρεται στην προσθήκη dNTP, Mg2+, παραγόντων επιμήκυνσης και παραγόντων ενίσχυσης ενίσχυσης στο σύστημα υπό την κατάλυση DNA πολυμεράσης, χρησιμοποιώντας το μητρικό DNA ως πρότυπο και ειδικούς εκκινητές ως σημείο εκκίνησης επέκτασης. Μέσω των σταδίων της μετουσίωσης, της ανόπτησης, της επέκτασης, κ.λπ., η διαδικασία in vitro αντιγραφής του θυγατρικού κλώνου DNA συμπληρωματικού προς το μητρικό πρότυπο DNA μπορεί γρήγορα και συγκεκριμένα να ενισχύσει οποιοδήποτε DNA στόχο in vitro.
1. Hot Start PCR
Ο χρόνος έναρξης της ενίσχυσης στη συμβατική PCR δεν είναι να τοποθετηθεί η μηχανή PCR στη μηχανή PCR και στη συνέχεια το πρόγραμμα αρχίζει να ενισχύεται.Όταν ολοκληρωθεί η διαμόρφωση του συστήματος, ξεκινά η ενίσχυση, η οποία μπορεί να προκαλέσει μη ειδική ενίσχυση και η PCR εν θερμώ εκκίνησης μπορεί να λύσει αυτό το πρόβλημα.
Τι είναι η hot start PCR;Αφού προετοιμαστεί το σύστημα αντίδρασης, ο τροποποιητής ενζύμου απελευθερώνεται σε υψηλή θερμοκρασία (συνήθως υψηλότερη από 90°C) κατά το αρχικό στάδιο θέρμανσης της αντίδρασης ή το στάδιο «θερμής εκκίνησης», έτσι ώστε να ενεργοποιηθεί η πολυμεράση DNA.Ο ακριβής χρόνος και η θερμοκρασία ενεργοποίησης εξαρτώνται από τη φύση της πολυμεράσης DNA και του τροποποιητή θερμής εκκίνησης.Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί κυρίως τροποποιητές όπως αντισώματα, συνδέτες συγγένειας ή χημικούς τροποποιητές για την αναστολή της δραστηριότητας της DNA πολυμεράσης.Δεδομένου ότι η δραστηριότητα της πολυμεράσης DNA αναστέλλεται σε θερμοκρασία δωματίου, η τεχνολογία θερμής εκκίνησης παρέχει μεγάλη ευκολία για την προετοιμασία πολλαπλών συστημάτων αντίδρασης PCR σε θερμοκρασία δωματίου χωρίς να θυσιάζεται η ειδικότητα των αντιδράσεων PCR.
2. RT-PCR
Το RT-PCR (Reverse transcription PCR) είναι μια πειραματική τεχνική για την αντίστροφη μεταγραφή από mRNA σε cDNA και τη χρήση του ως πρότυπο για ενίσχυση.Η πειραματική διαδικασία είναι η εξαγωγή ολικού RNA σε ιστούς ή κύτταρα πρώτα, χρήση Oligo (dT) ως εκκινητής, χρήση ανάστροφης μεταγραφάσης για σύνθεση cDNA και στη συνέχεια χρήση cDNA ως πρότυπο για ενίσχυση PCR για λήψη του γονιδίου στόχου ή ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης.
3. Φθορίζουσα ποσοτική PCR
Φθορίζουσα ποσοτική PCR (ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο,RT-qPCR) αναφέρεται στη μέθοδο προσθήκης ομάδων φθορισμού στο σύστημα αντίδρασης PCR, χρησιμοποιώντας τη συσσώρευση σημάτων φθορισμού για την παρακολούθηση ολόκληρης της διαδικασίας PCR σε πραγματικό χρόνο και, τέλος, χρησιμοποιώντας την τυπική καμπύλη για την ποσοτική ανάλυση του προτύπου.Οι κοινώς χρησιμοποιούμενες μέθοδοι qPCR περιλαμβάνουν το SYBR Green I και το TaqMan.
4. Ένθετη PCR
Η Nested PCR αναφέρεται στη χρήση δύο σετ εκκινητών PCR για δύο γύρους ενίσχυσης PCR και το προϊόν ενίσχυσης του δεύτερου γύρου είναι το θραύσμα γονιδίου στόχου.
Εάν μια αναντιστοιχία του πρώτου ζεύγους εκκινητών (εξωτερικοί εκκινητές) προκαλέσει την ενίσχυση ενός μη ειδικού προϊόντος, η πιθανότητα η ίδια μη ειδική περιοχή να αναγνωριστεί από το δεύτερο ζεύγος εκκινητών και να συνεχίσει να ενισχύεται είναι πολύ μικρή, οπότε η ενίσχυση με το δεύτερο ζεύγος εκκινητών, η ειδικότητα της PCR έχει βελτιωθεί.Ένα πλεονέκτημα της εκτέλεσης δύο γύρων PCR είναι ότι βοηθά στην ενίσχυση επαρκούς προϊόντος από περιορισμένο αρχικό DNA.
5. Touchdown PCR
Το Touchdown PCR είναι μια μέθοδος για τη βελτίωση της ειδικότητας της αντίδρασης PCR με προσαρμογή των παραμέτρων του κύκλου PCR.
Στην touchdown PCR, η θερμοκρασία ανόπτησης για τους πρώτους κύκλους ρυθμίζεται λίγους βαθμούς πάνω από τη μέγιστη θερμοκρασία ανόπτησης (Tm) των εκκινητών.Η υψηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά τη μη ειδική ενίσχυση, αλλά ταυτόχρονα, η υψηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης θα επιδεινώσει τον διαχωρισμό των εκκινητών και των αλληλουχιών-στόχων, με αποτέλεσμα μειωμένη απόδοση PCR.Επομένως, στους πρώτους κύκλους, η θερμοκρασία ανόπτησης συνήθως ρυθμίζεται να μειώνεται κατά 1°C ανά κύκλο για να αυξηθεί το περιεχόμενο του γονιδίου στόχου στο σύστημα.Όταν η θερμοκρασία ανόπτησης μειωθεί στη βέλτιστη θερμοκρασία, η θερμοκρασία ανόπτησης διατηρείται για τους υπόλοιπους κύκλους.
6. Απευθείας PCR
Η άμεση PCR αναφέρεται στην ενίσχυση του DNA στόχου απευθείας από το δείγμα χωρίς την ανάγκη απομόνωσης και καθαρισμού νουκλεϊκού οξέος.
Υπάρχουν δύο τύποι άμεσης PCR:
άμεση μέθοδος: πάρτε μια μικρή ποσότητα δείγματος και προσθέστε το απευθείας στο PCR Master Mix για αναγνώριση PCR.
μέθοδος πυρόλυσης: μετά τη δειγματοληψία του δείγματος, προσθέστε το στο προϊόν λύσης, λύστε για να απελευθερωθεί το γονιδίωμα, πάρτε μια μικρή ποσότητα λυμένου υπερκειμένου και προσθέστε το στο PCR Master Mix, εκτελέστε ταυτοποίηση PCR.Αυτή η προσέγγιση απλοποιεί τη ροή εργασιών του πειράματος, μειώνει τον χρόνο χρήσης και αποφεύγει την απώλεια DNA κατά τη διάρκεια των σταδίων καθαρισμού.
7. SOE PCR
Το μάτισμα γονιδίων με επικάλυψη επέκτασης PCR (SOE PCR) χρησιμοποιεί εκκινητές με συμπληρωματικά άκρα για να κάνει τα προϊόντα PCR να σχηματίζουν επικαλυπτόμενες αλυσίδες, έτσι ώστε στην επακόλουθη αντίδραση ενίσχυσης, μέσω της επέκτασης των επικαλυπτόμενων αλυσίδων, διαφορετικές πηγές τεχνικής Α στην οποία τα ενισχυμένα θραύσματα επικαλύπτονται και ενώνονται μεταξύ τους.Αυτή η τεχνολογία έχει επί του παρόντος δύο κύριες κατευθύνσεις εφαρμογής: κατασκευή γονιδίων σύντηξης.γονιδιακή θέση-κατευθυνόμενη μετάλλαξη.
8. IPCR
Η αντίστροφη PCR (IPCR) χρησιμοποιεί αντίστροφους συμπληρωματικούς εκκινητές για να ενισχύσει θραύσματα DNA εκτός των δύο εκκινητών και ενισχύει άγνωστες αλληλουχίες και στις δύο πλευρές ενός γνωστού θραύσματος DNA.
Το IPCR σχεδιάστηκε αρχικά για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας γειτονικών άγνωστων περιοχών και χρησιμοποιείται κυρίως για τη μελέτη αλληλουχιών γονιδιακών προαγωγέων.ογκογόνες χρωμοσωμικές αναδιατάξεις, όπως η σύντηξη γονιδίων, η μετατόπιση και η μετάθεση.και ενσωμάτωση ιικού γονιδίου, χρησιμοποιούνται επίσης συνήθως τώρα. Για την κατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση, αντιγράψτε ένα πλασμίδιο με την επιθυμητή μετάλλαξη.
9. dPCR
Η ψηφιακή PCR (dPCR) είναι μια τεχνική για τον απόλυτο ποσοτικό προσδιορισμό των μορίων νουκλεϊκού οξέος.
Υπάρχουν επί του παρόντος τρεις μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μορίων νουκλεϊκού οξέος.Η φωτομετρία βασίζεται στην απορρόφηση των μορίων νουκλεϊκού οξέος.Η ποσοτική PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο (Real Time PCR) βασίζεται στην τιμή Ct και η τιμή Ct αναφέρεται στον αριθμό κύκλου που αντιστοιχεί στην τιμή φθορισμού που μπορεί να ανιχνευθεί.Η ψηφιακή PCR είναι η πιο πρόσφατη Ποσοτική τεχνολογία που βασίζεται στη μέθοδο PCR ενός μορίου για μέτρηση νουκλεϊκών οξέων Η ποσοτικοποίηση είναι μια απόλυτη ποσοτική μέθοδος.
Ώρα δημοσίευσης: Ιούν-13-2023