Χρήση και προφυλάξεις του σωλήνα φυγοκέντρησης υπερδιήθησης
1) Επιλέξτε έναν κατάλληλο σωλήνα υπερδιήθησης.Σημειώστε ότι οι μεμβράνες UF διαφέρουν ως προς το επίπεδο ανοχής τους σε διάφορες χημικές ουσίες.Τυπικά, οι σωλήνες υπερδιήθησης με αποκοπή μοριακού βάρους 10 kDa μπορούν να επιλεγούν με αποκοπή μοριακού βάρους που δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερη από το 1/3 του μοριακού βάρους της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος, όπως 35 kDa.Εάν το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης που ενδιαφέρει είναι περίπου 10 kd, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας σωλήνας υπερδιήθησης με αποκοπή μοριακού βάρους 3 KD.
(2) Η υπερδιήθηση, πρόσφατα αγορασμένη, είναι στεγνή, με υπερκαθαρό νερό να προστίθεται πριν από τη χρήση και το νερό να έχει περάσει τελείως από τη μεμβράνη, το λουτρό πάγου ή το ψυγείο προψυχθέν για λίγα λεπτά.Στη συνέχεια χύνεται το νερό, δηλαδή το υγρό πρωτεΐνης, και πόση ποσότητα προστίθεται, όποιο δεν είναι μεγαλύτερο από τη λευκή γραμμή στο πάνω μέρος του σωλήνα.Η λειτουργία είναι ελαφριά και ο σωλήνας υπερδιήθησης πρέπει να προψυχθεί σε πάγο πριν προστεθεί το διάλυμα πρωτεΐνης.
3) Τόσο η μάζα όσο και το κέντρο βάρους έπρεπε να φτάσουν στην ισορροπία.Σημειώστε ότι η ταχύτητα περιστροφής και η επιτάχυνση δεν είναι πολύ γρήγορες, διαφορετικά καταστρέφουν άμεσα τη μεμβράνη υπερδιήθησης.Ξεκίνησε η φυγόκεντρη υπερδιήθηση (η φυγόκεντρος προψύχθηκε στους 4 βαθμούς).Μετά τη μετατροπή του RPM διαφορετικών φυγοκεντρητών σε g, ήταν διαφορετική.Η επιτάχυνση της φυγόκεντρου ρυθμίστηκε στο ελάχιστο, μειώνοντας την πίεση στη μεμβράνη.Σημείωση, φροντίστε να εγκαταλείψετε τη φυγόκεντρο αφού η φυγόκεντρος φτάσει στην ταχύτητα προορισμού της ή εάν έχετε πρόβλημα, δεν μπορείτε να το χειριστείτε για πρώτη φορά.Ο προσανατολισμός της μεμβράνης προς την άτρακτο ρυθμίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες (η γωνιακή θήκη φυγόκεντρου είναι η μεμβράνη προς τον άξονα κάθετο).Στην πρακτική χρήση, η γενική ταχύτητα περιστροφής είναι χαμηλότερη από αυτή που αναγράφεται στις οδηγίες, έτσι ώστε να μπορεί να παραταθεί η διάρκεια ζωής του σωλήνα φυγοκέντρησης.
3) Τόσο η μάζα όσο και το κέντρο βάρους έπρεπε να φτάσουν στην ισορροπία.Σημειώστε ότι η ταχύτητα περιστροφής και η επιτάχυνση δεν είναι πολύ γρήγορες, διαφορετικά καταστρέφουν άμεσα τη μεμβράνη υπερδιήθησης.Ξεκίνησε η φυγόκεντρη υπερδιήθηση (η φυγόκεντρος προψύχθηκε στους 4 βαθμούς).Μετά τη μετατροπή του RPM διαφορετικών φυγοκεντρητών σε g, ήταν διαφορετική.Η επιτάχυνση της φυγόκεντρου ρυθμίστηκε στο ελάχιστο, μειώνοντας την πίεση στη μεμβράνη.Σημείωση, φροντίστε να εγκαταλείψετε τη φυγόκεντρο αφού η φυγόκεντρος φτάσει στην ταχύτητα προορισμού της ή εάν έχετε πρόβλημα, δεν μπορείτε να το χειριστείτε για πρώτη φορά.Ο προσανατολισμός της μεμβράνης προς τον άξονα προσαρμόστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες (η γωνιακή θήκη φυγόκεντρου είναι κάθετη μεμβράνη προς άξονα).Στην πρακτική χρήση, η γενική ταχύτητα περιστροφής είναι χαμηλότερη από αυτή που αναγράφεται στις οδηγίες, έτσι ώστε να μπορεί να παραταθεί η διάρκεια ζωής του σωλήνα φυγοκέντρησης.
(4) Όταν συμπυκνωθεί στο υπόλοιπο 1 ml, πάρτε 50 ul ρυθμιστικού διαλύματος, προσθέστε 10 λίτρα ροής και δείτε εάν υπάρχει μπλε χρώμα, για να κρίνετε εάν λείπει πρωτεΐνη από τον σωλήνα υπερδιήθησης.Εάν ο σωλήνας παρουσιάζει διαρροή, χύστε ξανά το ανώτερο στρώμα και ρίξτε μέσα σε ένα νέο σωλήνα για να ξεκινήσει η υπερδιήθηση.Για να προσδιορίσετε επακριβώς εάν χάθηκαν τα σωληνάρια, φυγοκεντρήστε για 10 λεπτά με 5 mg BSA πριν από τη ροή, με κόλλα πρωτεΐνης ή ακατέργαστη ανάλυση Bradford και συνεχίστε προσθέτοντας το υπόλοιπο διάλυμα συμπυκνωμένης πρωτεΐνης (το οποίο λειτουργεί στον πάγο και εμποδίζει τη θέρμανση των πρωτεϊνών) μέχρι όλο το συμπύκνωμα έχει προστεθεί.Προσέξτε κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης εάν σημειωθεί κατακρήμνιση πρωτεϊνών, που οδηγεί σε κλείσιμο του σωλήνα.Εάν συμβεί καθίζηση, προσδιορίστε εάν η συγκεκριμένη αιτία της καθίζησης είναι μια υπερβολική συγκέντρωση πρωτεΐνης ή ένα ακατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα.Το πρώτο μπορεί να επιλυθεί με υπερδιήθηση πολλαπλών σωλήνων υπερδιήθησης ταυτόχρονα, μειώνοντας τη συγκέντρωση, και το δεύτερο με ανταλλαγή διαφορετικών ρυθμιστικών διαλυμάτων έως ότου δεν συμβεί καθίζηση της πρωτεΐνης.
(4) Όταν συμπυκνωθεί στο υπόλοιπο 1 ml, πάρτε 50 ul ρυθμιστικού διαλύματος, προσθέστε 10 λίτρα ροής και δείτε εάν υπάρχει μπλε χρώμα, για να κρίνετε εάν λείπει πρωτεΐνη από τον σωλήνα υπερδιήθησης.Εάν ο σωλήνας παρουσιάζει διαρροή, χύστε ξανά το ανώτερο στρώμα και ρίξτε μέσα σε ένα νέο σωλήνα για να ξεκινήσει η υπερδιήθηση.Για να προσδιορίσετε επακριβώς εάν χάθηκαν τα σωληνάρια, φυγοκεντρήστε για 10 λεπτά με 5 mg BSA πριν από τη ροή, με κόλλα πρωτεΐνης ή ακατέργαστη ανάλυση Bradford και συνεχίστε προσθέτοντας το υπόλοιπο διάλυμα συμπυκνωμένης πρωτεΐνης (το οποίο λειτουργεί στον πάγο και εμποδίζει τη θέρμανση των πρωτεϊνών) μέχρι όλο το συμπύκνωμα έχει προστεθεί.Προσέξτε κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης εάν σημειωθεί κατακρήμνιση πρωτεϊνών, που οδηγεί σε κλείσιμο του σωλήνα.Εάν συμβεί καθίζηση, προσδιορίστε εάν η συγκεκριμένη αιτία της καθίζησης είναι μια υπερβολική συγκέντρωση πρωτεΐνης ή ένα ακατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα.Το πρώτο μπορεί να επιλυθεί με υπερδιήθηση πολλαπλών σωλήνων υπερδιήθησης ταυτόχρονα, μειώνοντας τη συγκέντρωση, και το δεύτερο με ανταλλαγή διαφορετικών ρυθμιστικών διαλυμάτων έως ότου δεν συμβεί καθίζηση της πρωτεΐνης.
(5) Τα πρώτα λίγα βήματα χρησιμοποιούνται για τη συμπύκνωση της πρωτεΐνης και εάν το ρυθμιστικό διάλυμα πρόκειται να αλλάξει, προσθέστε απαλά νέο ρυθμιστικό διάλυμα (υπερδιήθηση μέσω μεμβράνης υπερδιήθησης 0,22um) σε περίπου 1 ml ολικής πρωτεΐνης και επανασυμπυκνώστε σε περίπου 1 ml για τρεις διαδοχικές φορές, με τον τελικό συμπυκνωμένο τελικό όγκο να εξαρτάται από την επιθυμητή συγκέντρωση πρωτεΐνης, γενικά όχι περισσότερο από 500 ul, αλλά και εντός 200 λίτρων.Επιτύχετε 1000 × ή περισσότερο σε τρεις περιπτώσεις, ουσιαστικά τόση αλλαγή buffer, όπως υπολογίζεται με εμπλουτισμό όγκου τουλάχιστον 10 × περίπου κάθε φορά.
(5) Τα πρώτα λίγα βήματα χρησιμοποιούνται για τη συμπύκνωση της πρωτεΐνης και εάν το ρυθμιστικό διάλυμα πρόκειται να αλλάξει, προσθέστε απαλά νέο ρυθμιστικό διάλυμα (υπερδιήθηση μέσω μεμβράνης υπερδιήθησης 0,22um) σε περίπου 1 ml ολικής πρωτεΐνης και επανασυμπυκνώστε σε περίπου 1 ml για τρεις διαδοχικές φορές, με τον τελικό συμπυκνωμένο τελικό όγκο να εξαρτάται από την επιθυμητή συγκέντρωση πρωτεΐνης, γενικά όχι περισσότερο από 500 ul, αλλά και εντός 200 λίτρων.Επιτύχετε 1000 × ή περισσότερο σε τρεις περιπτώσεις, ουσιαστικά τόση αλλαγή buffer, όπως υπολογίζεται με εμπλουτισμό όγκου τουλάχιστον 10 × περίπου κάθε φορά.
Ώρα δημοσίευσης: Νοε-09-2022